Bens S, Haake A, Richter J, Leohold J, Kolarova J, Vater I,Riepe FG, Buiting K, Eggermann T, Gillessen-Kaesbach G,Platzer K, Prawitt D, Caliebe A, Siebert R.

Nhiều gen khác nhau nằm tại những vị trí imprinting (tạm gọi là dấu ấn di truyền) được điều hòa bởi cơ chế biểu sinh có liên quan tới kiểm soát sự phát triển và biệt hóa. Sự thay đổi kiểu hình của những rối loạn imprinting gợi ý rằng các cá thể với những sai sót bẩm sinh của “dấu ấn di truyền” có thể vẫn không được phát hiện trong những bệnh nhân là trẻ sinh thiếu cân (SGA). Đánh giá, định lượng phân tích sự methyl hóa DNA tại những vùng bị methyl hóa khác nhau (DMRs) của 10 vị trí imprinting (PLAGL1, IGF2R, DMR2, GRB10, H19 DMR, IGF2, MEG3, NDN, SNRPN, NESP, NESPAS) bằng phương pháp pyrosequencing bisulphite trên 98 bệnh nhân là trẻ sinh thiếu cân so sánh với 50 đối chứng.

Đối với IGF2R DMR2, mẫu phân tích methyl hoá được bổ sung thêm 47 cặp bố mẹ và một mình mẹ (95 người) của những bệnh nhân trong nhóm trẻ sinh thiếu cân. 6 trong số 98 bệnh nhân là trẻ sinh thiếu cân đã phát hiện ra sự thay đổi methyl hóa DNA tại một vị trí đơn.

Một trẻ được chẩn đoán với những triệu chứng upd(14)mat do đột biến epimutation* của vị trí MEG3 trong vùng 14q32 đã được chứng minh. 5 bệnh nhân còn lại cho thấy sự methyl hóa thấp tại GRB10 và vùng gắn H19 3CTCF, nhưng lại tăng cường methyl hóa tại NDN và IGF2. Sự tăng cường methyl hóa tại IGF2R DMR2 được phát hiện ở 5 bệnh nhân, 6 bố mẹ của nhóm trẻ sinh thiếu cân và ở 2 người thuộc nhóm đối chứng. Như vậy có thể kết luận rằng có tốn tại sự methyl hóa khác thường tại những vị trí imprinting của trẻ sinh thiếu cân nhưng dường như rất hiếm xảy ra nếu như những triệu chứng imprinting bị loại bỏ. Nghiên cứu xa hơn sự biến đổi sinh lý và hậu quả về chức năng của sự methyl hóa bất thường là cần thiết trước khi đưa ra kết luận cuối cùng trên những tác động lâm sàng có thể được rút ra.

* Đột biến epimutation: Đột biến ngoài gen (là những biến đổi có thể di truyền nhưng không làm sai lệch trình tự DNA, vị dụ như mức độ hay tần suất methyl hoá, histon hoá…)

Thông tin chi tiết có thể đọc tại link: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed

Lược dịch: NHV

Bệnh hemophilia (còn gọi là bệnh ưa chảy máu) một bệnh di truyền do thiếu hụt hay bất thường chức năng của các yếu tố đông máu VIII, IX hay XI. Trong đó, sự thiếu hụt yếu tố VIII là thường gặp nhất trong bệnh hemophilia A. Đây là bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể giới tính X nên bệnh gặp chủ yếu ở nam giới và nữ giới là người mang gen bệnh. Biểu hiện bệnh trên lâm sàng chủ yếu là chảy máu, mức độ chảy máu có thể là nhẹ, trung bình hoặc nặng tùy thuộc vào nồng độ của yếu tố VIII trong huyết tương. Mức độ nhẹ thì chảy máu xảy ra sau chấn thương hoặc sau phẫu thuật. Ở mức độ nặng, chảy máu thường xảy ra tự phát hoặc sau những sang chấn nhẹ, nhất là ở khớp và cơ. Chẩn đoán chính xác và điều trị sớm căn bệnh này có một ý nghĩa quan trọng nhằm hạn chế tối đa tình trạng chảy máu cũng như giảm thiểu khả năng bệnh nhân trở thành tàn tật. Tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân tử ngày nay cho phép phân tích DNA để phát hiện những tổn thương gen gây ra bệnh hemophilia A, phát hiện người lành mang gen bệnh và ứng dụng trong chẩn đoán trước sinh cũng như tư vấn di truyền.

I. BỆNH HỌC PHÂN TỬ BỆNH HEMOPHILIA A

Đây là bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể giới tính X, người mẹ sẽ truyền bệnh cho con trai, hoặc truyền gen bệnh cho con gái ở trạng thái dị hợp tử. Những người con gái dị hợp tử này khi xây dựng gia đình, sinh con lại có thể truyền bệnh cho con trai và các con gái của mình ở trạng thái dị hợp tử. Tuy nhiên, khoảng 1/3 các trường hợp là do đột biến mới phát sinh trong quá trình tạo giao tử ở bố hoặc mẹ.

Hình 1. Kiểu gen và kiểu hình của bố mẹ và thế hệ con. XHXh: nữ mang gen bệnh, XHXH: nữ bình thường, XhXh: nữ mắc bệnh, XHY: nam bình thường, XhY: nam mắc bệnh.

Bệnh hemophilia còn được biết đến như căn bệnh của Hoàng gia vì nữ hoàng Anh Victoria 1838-1901 mang gen bệnh này và truyền nó cho thành viên của nhiều thế hệ Hoàng gia.

Hình 2. Phả hệ di truyền bệnh hemophilia A của các thành viên trong Hoàng gia Anh.

Gen mã hoá yếu tố VIII: Gen quy định tổng hợp yếu tố VIII (FVIII) là một trong những gen lớn cơ thể, có kích thước 186 kb, gồm 25 intron và vùng gen mã hóa dài 9 kb với 26 exon trong đó 24 exon có kích thước từ 62 bp- 262 bp và 2 exon lớn nhất exon 14 (3106 bp) và exon 26 (1958 bp). Gen F8 mã hóa cho protein yếu tố VIII gồm 2332 acid amin và có trọng lượng phân tử khoảng 300 kD. Gồm chuỗi nặng có kích thước 200 kD trong một phức hợp ion kim loại với chuỗi nhẹ có kích thước 80 kD. Khi gen F8 bị đột biến, tế bào giảm hoặc mất khả năng tổng hợp yếu tố VIII gây nên bệnh hemophilia A. Có nhiều dạng đột biến gen gây bệnh hemophilia A trong đó phổ biến nhất là đột biến điểm và đảo đoạn intron. Trong một nghiên cứu thống kê dữ liệu đột biến 845 gia đình có người nhà là bệnh nhân hemophilia A, Oldenburg và cộng sự đã chỉ ra rằng các dạng đột biến điểm (thay thế nucleotid gây đột biến sai nghĩa hoặc vô nghĩa) chiếm tỉ lệ cao nhất (47.5%) tiếp đến là dạng đột biến đảo đoạn bao gồm đảo đoạn intron 1và intron 22 (36.7%), còn lại là đột biến xóa đoạn gen chiếm khoảng 10-15%. Tùy thuộc vào kiểu và vị trí đột biến trên gen F8 mà gây ra các thể bệnh nặng nhẹ khác nhau [Hình 3].

Hình 3. Cấu trúc phân tử protein và một số loại đột biến hay gặp ở yếu tố VIII. Phân tử protein yếu tố VIII dạng tiền thân gồm vùng dẫn tín hiệu (SP), các vùng chức năng lớn A1, A2, B, A3 , C1, C2, các vùng chức năng xen kẽ a1, a2, a3. Các yếu tố thuộc hệ thống đông máu như yếu tố X, Xa, IXa, vWF, Phospholipid tương tác với yếu tố VIII tại những vị trí axit amin nhất định (kí hiệu số). Tùy thuộc vào kiểu và vị trí đột biến trên gen F8 mà mức độ bệnh thay đổi, những đột biến gây thể bệnh nặng được kí hiệu màu đỏ, đột biến gây thể bệnh nhẹ-trung bình kí hiệu màu đen.

II. CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH HEMOPHLIA A

Chẩn đoán trước sinh để đưa ra những tư vấn di truyền là một giải pháp hiệu quả nhất giúp ngăn ngừa và làm giảm tỉ lệ mắc bệnh. Chẩn đoán trước sinh bằng phương pháp chọc ối được thực hiện ở tuần mang thai thứ 16 đối với các bà mẹ mang gen ở trạng thái dị hợp tử (người lành mang gen bệnh), các trường hợp này chiếm khoảng 2/3, còn lại 1/3 các trường hợp các bà mẹ không mang gen, tức là đột xuất hiện ở người con trai bị bệnh là đột biến mới phát sinh trong quá trình tạo giao tử, người mẹ không mang gen khi mang thai không cần làm chẩn đoán trước sinh.

Một gia đình có con trai bị bệnh hemophilia A khi có kế hoạch sinh con tiếp theo cần phải thực hiện theo các bước sau:

- Xác định đột biến gen trên bệnh nhân: Phân tích xét nghiệm đột biến gen cho người con trai bị bệnh để xác định vị trí đột biến trên gen F8, việc này hết sức quan trọng và cần thiết để giúp phát hiện tình trạng mang gen ở người mẹ. Thời gian phân tích gen cho bệnh nhân khoảng 1-3 tháng.

- Phát hiện người lành mang gen bệnh: Dựa vào vị trí đột biến của người con trai, xác định tình trạng mang gen bệnh trên người mẹ, nếu người mẹ mang gen bệnh thì khi mang thai cần chọc ối để làm chẩn đoán trước sinh (chiếm 2/3), nếu người mẹ không mang gen bệnh không cần thiết làm chẩn đoán trước sinh (chiếm 1/3). Thời gian phân tích gen cho người mẹ khoảng 7-10 ngày.

- Chẩn đoán trước sinh: Các bà mẹ nếu biết rõ kết quả xét nghiệm gen của người con trai bị bệnh (hoặc người có cùng quan hệ huyết thống) sẽ giúp xác định nhanh tình trạng gen của thai nhi. Việc xác định đột biến của thai nhi sẽ dựa vào vị trí đột biến chỉ điểm của người con trai bị bệnh. Thời gian khoảng 7-10 ngày.

Các phương pháp xác định đột biến gen F8

Có nhiều phương pháp để xác định đột biến gen, tuỳ thuộc vào kiểu đột biến mà có các phương pháp phân tích khác nhau.

Xác định đột biến điểm: Đột biến điểm gen F8 nằm rải rác khắp chiều dài gen nên giải trình gen tự trực tiếp là phương pháp được nhiều người lựa chọn. Tại Việt Nam, phát hiện đột biến điểm gen F8 bằng kỹ thuật giải trình tự gen hiện nay đang được tiến hành tại Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội. Bằng cách thiết kế 38 cặp bao phủ toàn bộ chiều dài gen F8, 26 exon của gen F8 được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR và tiến hành giải trình tự. Do có kích thước lớn nhất, exon 14 được thiết kế 9 cặp mồi và exon 26 được thiết kế 5 cặp mồi để khuếch đại toàn bộ chiều dài exon.

Hình 4. Hình ảnh giải trình tự exon 14 gen F8 của DNA người mẹ và DNA chị gái bệnh nhân bị đột biến del2605C. Mũi tên thẳng đứng chỉ vị trí đột biến, các chữ số trên mũi tên chỉ vị trí nucleotid và acid amin thay đổi.

(Kết quả được thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein,Trường Đại học Y Hà Nội)

Kết quả giải trình tự gen ở hình 4 cho thấy bệnh nhân có đột biến mất 1 nucleotid C tại vị trí 2605 thuộc exon 14 của gen F8, người mẹ bệnh nhân xuất hiện các đỉnh chồng lên nhau sau điểm đột biến, điều này chỉ ra rằng người mẹ ở trạng thái dị hợp tử (người lành mang gen bệnh), chị gái bệnh nhân cho thấy trình tự exon 14 hoàn toàn trùng khớp với người bình thường, như vậy chị gái bệnh nhân là người không mang gen bệnh (trường hợp này không cần làm chẩn đoán trước sinh khi mang thai).

Hình 5. Kết quả giải trình tự exon 14 gen F8 của một gia đình bệnh nhân hemophilia A. So sánh kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân với kết quả của người bình thường cho thấy, tại vị trí 2605 trên trình tự GeneBank (NM_000132) trình tự nucleotid C của bệnh nhân đã bị mất. Trong khi đó kết quả giải trình tự ở mẫu mẹ bệnh nhân cho thấy có hình ảnh các peak chồng lên nhau sau điểm đột biến. Điều này chỉ ra rằng mẹ bệnh nhân ở trạng thái dị hợp tử (mang gen bệnh). Bà mẹ sau đó có thai đã chọc ối để làm được chẩn đoán trước sinh. Kết quả phân tích exon 14 của gen F8 cho thấy thai nhi cũng bị mất nucleotid C tại vị trí 2605 trên trình tự GeneBank (NM_000132) giống như người anh trai.

(Kết quả được thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein,Trường Đại học Y Hà Nội)

Xác định đột biến đảo đoạn: Do đặc điểm vùng intron 22 và hai phân vùng có trình tự tương đồng xảy ra đảo đoạn đều có kích thước lớn (>10 kb) nên việc phát hiện đột biến đảo đoạn đòi hỏi sử dụng kĩ thuật PCR khuếch đại đoạn có kích thước lớn (Long distance PCR, LD-PCR).

Kỹ thuật Inversion PCR xác định đột biến đảo đoạn intron 22 đã được tiến hành thành công tại Trung tâm nghiên cứu Gen-protein, Trường Đại học Y Hà nội để xác định đột biến gen trên bệnh nhân hemophilia A và xác định người lành mang gen bệnh.

Hình 6. Kỹ thuật Inversion PCR để phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22. Hình ảnh I-PCR (A) 1 Marker kích thước 100bp, 2 Người bình thường, 3 Bệnh nhân đột biến đảo đoạn int22, 4 Người mẹ mang gen bệnh. Sản phẩm I-PCR được giải trình tự gen (B)

(Kết quả được thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein,Trường Đại học Y Hà Nội)

Kết quả hình 6 cho thấy người bình thường vị trí giếng số 2 có 1 băng kích thước tương ứng 487 bp. Ở giếng số 3 là bệnh nhân Hemophilia A thể nặng có 1 băng kích thước tương ứng 559 bp. Điều này chứng tỏ bệnh nhân bị đột biến đảo đoạn intron 22. Còn người mẹ bệnh nhân ở giếng số 4 có 2 vạch DNA kích thước tương ứng là 487 và 559bp, như vậy kết luận người mẹ là người mang gen bệnh. Kết quả giải trình tự gen hình 11B cho thấy trình tự thu được tương đồng với trình tự genebank của yếu tố VIII.

III. HƯỚNG ĐIỀU TRỊ

Điều trị bệnh hemophilia dựa vào các nguyên tắc sau: điều trị chảy máu, điều trị dự phòng và phục hồi chức năng. Trong đó, việc sử dụng các chế phẩm thay thế đóng vai trò chủ chốt. Trong những năm qua, đã có nhiều tiến bộ trong điều trị bệnh như truyền máu toàn phần, huyết tương tươi đông lạnh, tủa lạnh yếu tố VIII, yếu tố cô đặc có độ tinh khiết từ mức độ thấp đến mức độ cao. Tuy nhiên, các sản phẩm có nguồn gốc từ máu thường có giá thành rất đắt, thời gian bán hủy ngắn nên phải tiêm tĩnh mạch đều đặn. Trong khi đó, nguồn cung cấp các chế phẩm này cũng hạn hẹp trong khi nhu cầu điều trị ngày một gia tăng, hơn nữa, các sản phẩm có nguồn gốc từ máu không phải là tuyệt đối an toàn. Bệnh nhân sử dụng các phương pháp điều trị này vẫn có nguy cơ tiềm ẩn mắc các bệnh lây nhiễm qua đường truyền máu như HIV, HBV, HCV. Khoảng 60-70% bệnh nhân hemophilia nặng bị nhiễm HIV (Human Immunodeficiency Virus) và khoảng 80% bệnh nhân hemophilia bị nhiễm virus viêm gan do điều trị các chế phẩm từ máu.

Với sự tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân tử, các nhà khoa học đã thành công trong việc sản xuất yếu tố VIII tái tổ hợp ứng dụng trong điều trị bệnh hemophilia A. Đây có thể coi như là một bước đột phá trong việc nghiên cứu điều trị căn bệnh này. Ưu điểm của sinh phẩm là hàm lượng yếu tố VIII cao, có hiệu quả rõ rệt, bảo quản dễ, không có các yếu tố nguy cơ gây các bệnh truyền nhiễm. Việc điều trị bệnh hemophilia bằng liệu pháp gen (gene therapy) đã được thử nghiệm thành công trên mô hình động vật ở chuột VIII-/- đã đem lại những triển vọng đầy hứa hẹn đối với người bệnh hemophilia A.

Ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu của Tạ Thành Văn và cộng sự đã tách thành công dòng gen mã hóa yếu tố VIII của người bình thường. Đồng thời, nhóm tác giả này cũng đã thành công trong việc tạo ra yếu tố VIII bị xóa vùng gen B và vẫn giữ nguyên hoạt tính. Nhóm nghiên cứu đã thiết kế vector, biểu hiện và tinh chế thành công yếu tố VIII người ở E.coli, mở đường cho việc tổng hợp yếu tố VIII người tái tổ hợp trên hệ vi khuẩn. Bên cạnh đó, các tác giả này cũng đã thiết kế thành công vector thuộc hệ retrovirus mang yếu tố VIII người để phục vụ cho các nghiên cứu ứng dụng liệu pháp điều trị gen sau này tại Việt Nam.

TS. BS. Trần Vân Khánh

Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein

Bộ môn Bệnh học phân tử

Trường Đại học Y Hà Nội, số 1 phố Tôn Thất Tùng

Địa chỉ e-mail: Địa chỉ email này đã được bảo vệ từ spam bots, bạn cần kích hoạt Javascript để xem nó.

Mobile: 091 5958661